Известно, что компоненты стоматологических материалов (КСМ) например зубных протезов, могут вызывать как аллергию, так и реакции гиперчувствительности. Клинически аллергия на компоненты стоматологических материалов (КСМ) может проявляться зудом и жжением слизистой оболочки полости рта (СОПР), реже - хронической крапивницей на фоне приема лекарств. Механизмы аллергических реакций на компоненты стоматологических материалов (КСМ) различны, учитывая разнообразие входящих в них веществ, встречаются немедленные и замедленные реакции.
При кожной базофильной гиперчувствительности наблюдается опосредованная лимфоцитами замедленная аллергическая реакция с участием значительного количества базофилов.
Аппликационные кожные пробы (АП) рассматриваются как золотой стандарт тестирования на предмет аллергии к компонентам стоматологических материалов (КСМ) Однако, их результаты не всегда совпадают с реакциями слизистой оболочки полости рта (СОПР). Недостатки аппликационных кожных проб (АП) пробуждают интерес к поиску надежных тестов in vitro для подтверждения аллергии к компонентам стоматологических материалов.
Маркер активации базофилов CD63 (гранулоцит-ассоциированный тетраспан), исследовался ранее и сравнивался с аппликационными кожными пробами (АП), в результате чего сообщалось о его меньшей чувствительности и меньшей специфичности для диагностики лекарственной аллергии. Другой маркер активации базофилов - CD203c при лекарственной и пищевой аллергии (экто-нуклеотид-пирофосфатаза/фосфодиэстераза, трансмембранный эктофермент II типа) изучен при разных видах аллергии и оказался достаточно специфичным.
При сравнении экспрессии CD203c с CD63 под влиянием аллергенов обнаружено, что CD203c был лучшим маркером, чем CD63, для диагностики аллергии на латекс, CD63 более специфичен, а CD203c более чувствителен при аллергии на яд пчел и ос. Третье заключило, что CD63 был более чувствительным, чем CD203c, для диагностики аллергии на миорелаксанты, аCD203c более надежный по сравнению с CD63 при диагностике аллергии на кошачью шерсть.
Совместимость дентальных сплавов с биологической средой полости рта важна для изготовления безопасных для здоровья пациентов зубных протезов. Достаточно большое количество in vivo и in vitro исследований указывает на тот факт, что, подвергаясь процессам коррозии и механического износа, дентальные металлосодержащие конструкции выделяют в среду полости рта ионы металлов. Катионы металлов, соединяясь с белками, приобретают антигенные свойства, провоцируя, как местные, так и общие негативные реакции.
Цель исследования - определение активации базофилов крови и IgE-антител на компоненты стоматологических материалов (КСМ) у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ).
❗ Материал и методы исследования
Обследовано 22 пациента в возрасте от 42 до 74 лет, из них 4 мужчин и 18 женщин, с жалобами на непереносимостью стоматологических материалов (НСМ). Все пациенты указывали на наличие причинно-следственной связи между возникновением симптомов непереносимости зубопротезного материала и фактом контакта с ним.
Контрольную группу составили 20 пациентов (3 мужчин и 17 женщин) в возрасте от 45 до 68 лет без жалоб на непереносимость стоматологических материалов (НСМ) и без гиперчувствительности к ним, сопоставимые по полу, возрасту, типу конструкций и количеству зубопротезных единиц, согласившиеся пройти обследования на наличие гиперчувствительности к зубопротезным материалам, перед плановой заменой ортопедических конструкций. Сформированные группы были сопоставимы по возрасту и полу.
Интерпретация результатов кожного тестирования проводилась согласно общепринятой методике. Все пациенты, включенные в исследование, дали и собственноручно заполнили добровольное информированное согласие на участие в работе.
Уровень гигиены оценивали по упрощенному индексу гигиены полости рта OHI-S, а выраженность воспалительного процесса - при помощи индекса GI (оценивали зубы симметричной локализации противоположной стороны челюсти).
✔ Аппликационное кожное тестирование с растворами солей металлов.
Всем участникам исследования ставили аппликационные кожные пробы с использованием специальных аппликаторов - FinnChamberonScanpor (Epitest Ltd. Oy, Tulusa, Finland) и тестовых субстанций - солей металлов Cu2+, Co2+, Cr3+, Mg2+, Mn2+, Ni2+, Ti2+, Zn2+ на вазелиновой основе (Epitest Ltd. Oy, Tulusa, Finland). В качестве отрицательного контроля использовался чистый медицинский вазелин.
✔ Определение IgE-антител к металлам в сыворотке крови.
Для выявления IgE-антител к ионам металлов мы использовали стандартную иммуноферментную тест-систему фирмы EUROIMMUN (Германия). В качестве аллергенов были использованы аллергодиски с Ni-HSA, Cr-HSA, Co-HSA, Gold-HSA. Концентрацию IgE в исследуемых образцах определяли, внося полученные значения оптической плотности в калибровочный график.
✔ Подготовка компонентов стоматологических материалов (КСМ) для теста активации базофилов методом проточной цитометрии (ПЦ).
Жидкость фрагментов протезов (ЖФП), получали путем настаивания образца Co-Cr-сплава для изготовления ортопедических конструкций в 10 мл воды специальной очистки в течение 30 дней. Объем растворителя (10 мл) определяли согласно рекомендациям ISO 10993-5. Контролем служил растворитель без исследуемых образцов. Концентрацию ионов металлов в ЖФП определяли методом масс-спектрометрии.
Образец сплава для изготовления ортопедических конструкций "Gialloy PA" помещали в стерильную закрывающуюся пластиковую пробирку с растворителем и инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 дней. В течение всего периода инкубации ежедневно взвесь перемешивали на шейкере при комнатной температуре по 60 минут. Полученную жидкость, в количестве 1 мл помещали в стерильные полипропиленовые пробирки и заливали 1 мл 1,8% забуференного раствора хлорида натрия (ЗФР). Таким образом, получали ЖФП для инкубации с лейкоцитами крови.
Перед использованием в жидкость фрагментов протезов (ЖФП) добавляли человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в концентрации 2 г/л, в объеме, равном полученной жидкости. Масса образца для инкубации составила 4,4 г; при взвешивании на электронных весах Adventurer PRO AV 264. Наряду с хромом и кобальтом ЖФП содержала другие ионы (табл. 1).
Раствор солей металлов (РСМ) готовили в виде их смеси в равных пропорциях NiCl2, CrCl3, CоCl2, CuCl2, ZnCl2, MnCl2, готовили в концентрации 0,01 мг/мл в забуференном физиологическом растворе. Сывороточный альбумин человека в концентрации 2 г/л добавлялся к этому раствору непосредственно перед использованием.
В качестве негативных контролей использовались образцы нестимулированной цельной крови, инкубированной с ЗФР и ЧСА. Образцы крови пациентов разделяли в 4 пробирки (12×75 мм), использовали 100 мкл крови на тест: 2 стимулятора и 2 негативных контроля активации.
✔ Фенотипирование клеток
Для фенотипирования клеток кровь брали натощак из локтевой вены в пробирки с гепарином (20 Ед/мл). После добавления к 100 мкл гепаринизированной цельной крови в пробирки по 2,5 мкл жидкость фрагментов протезов (ЖФП) и раствора солей металлов (РСМ), исследуемые образцы ресуспендировали и культивировали в течение 15 мин при 37 °С в термостате. После чего добавляли 2,5 мкл раствора моноклональных антител CD203c-РЕ и CD63-FITC, перемешивали на вортексе и инкубировали 15 минут при комнатной температуре, затем добавляли раствор, лизирующий эритроциты, и инкубировали при 37 °С еще 10 мин, добавляли 500 мкл буферного раствора и фенотипировали.
Исследование проводили на проточном цитометре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc., США) с использованием моноклональных антител CD203c-РЕ и CD63-FITC. Использовали моноклональные антитела производства "Invitrogen Corporation", "Life Technologies Corporation", "Beckman Coulter",США.
✔ Статистический анализ
Результаты ПЦ-анализа анализировались вслепую, лаборант-оператор не знал о диагнозах пациентов. Наоборот, диагностика аллергии проводилась, прежде чем результаты проточной цитометрии (ПЦ) становились известны.
Расчеты показателей проводились в программе Statistica 10,0. Данные, подчиняющиеся закону нормального распределения (Shapiro-Wilkp>0,05), обрабатывались с помощью критерия T-test, непараметрические данные - с помощью критериев Mann-Whitney UTest (M-U), парного теста Wilcoxon Matched Pairs Test c указанием уровня достоверности расчета (p). Корреляция показателей оценивалась с помощью непараметрического теста Spearman Rank Order Correlations с указанием степени и уровня достоверности расчета (p). Для оценки значимости критериев применялся ROC-анализ с указанием чувствительности, специфичности, уровня значимости (AUC), достоверности (p). ROC-анализ проводили в программе MedCalc.
О качестве метода диагностики судили по экспертной шкале, которая базируется на величине AUC и имеет несколько градаций: площадь AUC, равная 0,9-1 - отличное качество модели, 0,8-0,9 - очень хорошее, 0,7-0,8 - хорошее, 0,6-0,7 - среднее, 0,5-0,6 - неудовлетворительное.
❗ Результаты исследования
✔ Аппликационные пробы
В опытную группу (n=22) были включены пациенты с положительными аппликационными пробами (АП) на соли металлов. У 6 (27,3%) пациентов АП были резко положительными, у 4 (18,2%) - сильноположительными и у 5 (22,7%) пациентов положительными к раствору соли NiCl2 (3%). К раствору соли CrCl3 (3%) по результатам проведения аппликационных проб (АП) у 5 (22,7%) пациентов были отмечены резкоположительные реакции, у 3 (13,63%) пациентов - сильноположительные и у 3 (13,63%) пациентов положительные реакции.
Кожная гиперчувствительность к раствору соли CoCl2(1%) у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) выявлена по аппликационным пробам (АП) у 8 пациентов, из них у 4 (18,2%) пациентов реакция была резкоположительной, у 2 (9%) пациентов сильноположительной и у 2 (9%) пациентов положительной.
При этом результаты проведения аппликационных проб (АП) были одновременно положительными на NiCl2 (3%) и CrCl3 (3%) - у 7 (31,8%) пациентов, на NiCl2 (3%) и CоCl2 (1%) - у 5 (22,7%) пациентов; на CrCl3 (3%) и CоCl2 (1%) - у 2 (9%) пациентов, а на NiCl2 (3%), CrCl3 (3%) и CоCl2 (1%) - у 2 (9%) пациентов.
✔ Тест активации базофилов у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ)
У пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) показано увеличение количества CD63+CD203c+ базофилов с использованием в качестве индуктора их активации раствор солей металлов (РСМ) и жидкость фрагментов протезов (ЖФП).
Процент аллерген-активированных базофилов определяли как процент базофилов, экспрессирующих маркер, минус его значение внестимулированной контрольной пробе. Диагностическую значимость оценивали при помощи метода ROC-анализа (анализа кривой Receiver-Operatorcharacteristic). Устанавливали оптимальную точку (критерий) отсечения (cut-ofvalue) для изучаемых признаков и определяли площадь под кривой (AUC или areaundercurve) для сравнения диагностической значимости выбранных признаков при установлении диагноза.
По результатам тестов рассчитывали оптимальный порог процента прироста CD63+CD203c+ базофилов при оптимальных значениях чувствительности (Se) и специфичности (Sp) для различных индукторов их активации.
Наилучшее соотношение чувствительности и специфичности наблюдалось для жидкости фрагментов протезов (ЖФП-А), где AUC был равен 0,86. Этот параметр указывает на высокую диагностическую значимость этого лабораторного теста (рис. 1).
При выборе из нескольких лабораторных тестов, обладающих сопоставимой диагностической мощностью, проводится их сравнение по другим дополнительным критериям. К ним относится соотношение "стоимость-эффективность" теста, а также неинвазивность, простота анализа и представления результатов, быстрота выполнения.
С учетом того, что получение жидкости фрагментов протезов (ЖФП) длительный процесс, требующий использования специального оборудования для оценки концентрации ионов металлов в растворе, раствор солей металлов (РСМ) является наиболее подходящим индуктором экспрессии CD63+CD203c+ на базофилах, сопоставимым по специфичности с ЖФП (рис. 1, 2) (табл. 2).
Медиана значений процента базофилов, экспрессирующих маркеры активации CD63+CD203c+ с ЖФП, были выше тех, которые наблюдались при использовании РСМ в качестве индуктора (табл. 3). Процент базофилов с РСМ был выше, чем с контрольными растворами - ЧСА, ЗФР (табл. 2). Уровень базофилов с последними (ЧСА, ЗФР) в опытной группе был достоверно выше, чем в контрольной группе (р <0,05), что указывает на активацию базофилов при непереносимости стоматологических материалов (НСМ).
Следует отметить, что у 17 пациентов опытной группы отмечался прирост количества базофилов с маркерами активации под влиянием жидкости фрагментов протезов (ЖФП), а у 5-ти, у которых их количество было исходно повышенным, наблюдалось его снижение.
Прирост количества CD63+CD203c+ базофилов, после 15-минутной инкубации с жидкостью фрагментов протезов (ЖФП), раствором солей металлов (РСМ), мы объясняем тем, что в случае присутствия на клетках IgE антител и при добавлении аллергена происходит его взаимодействие со связанными антителами в результате чего активируются базофилы. Увеличение количества CD63+CD203c+ базофилов у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) является важным диагностическим признаком у лиц с аллергией на компоненты стоматологических материалов (КСМ).
❗ Анализ корреляции результатов
Результаты, полученные при использовании жидкости фрагментов протезов (ЖФП) в качестве индуктора активации CD63+CD203c+, сильно и умеренно коррелировались результатами аппликационных проб (АП) с 3%-ным раствором соли NiCl2 через 24 ч (RSpearman=0,7; p <0,05) и 48 (RSpearman=0,79; p <0,05) ч с момента постановки. При использовании раствора солей металлов (РСМ) отмечена умеренная корреляция с результатами аппликационных проб (АП) с раствором соли NiCl2 через 48 ч с момента постановки АП (RSpearman =0,56; p <0,05) (табл. 4).
При постановке теста активации CD63+ CD203c+-базофилов с жидкостью фрагментов протезов (ЖФП) установлено наличие умеренной корреляции с результатами аппликационных проб (АП) с 3% раствором соли CrCl3 через 24 ч (RSpearman=0,45; p <0,05) и 48 (RSpearman=0,68; p <0,05) ч с момента постановки, а при использовании раствор солей металлов (РСМ) статистически значимая умеренная корреляция выявлена с результатами АП с 3%-ным раствором соли CrCl3 через 48 ч с момента постановки АП (RSpearman = 0,54; p <0,05).
Анализ взаимосвязи результатов постановки теста активации базофилов, по увеличению экспрессии CD63+CD203c+сЖФП, выявил наличие корреляции с результатами аппликационных проб (АП) с 1%-ным раствором соли CоCl2 через 24 ч (R Spearman = 0,7; p <0,05) и 48 (RSpearman=0,87; p <0,05) ч с момента постановки. С использованием раствора солей металлов (РСМ) в качестве индуктора экспресии CD63+CD203c+ статистически значимая умеренная корреляция выявлена с результатами АП с 1%-ным раствором соли CоCl2 через 48 ч с момента постановки аппликационных проб (АП) (RSpearman=0,62; p <0,05).
❗ Определение IgЕ-антител к солям металлов
IgЕ-антитела к Ni-HSA, в группе пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) выявлены у 16 (72,7%) пациентов в иммуноферментном анализе (ИФА). При обследовании сывороток крови пациентов контрольной группы IgE-антитела к Ni-HSA были выявлены у 2 (10%) пациентов (табл. 5).
IgE-антитела к Cr-HSA в группе пациентов с кожной гиперчувствительностью обнаружены у 14 (63,6%) пациентов. У пациентов контрольной группы обнаружены IgE-антитела к Cr-HSA методом иммуноферментного анализа (ИФА) у 1 (5%) пациента.
Методом ИФА IgE-антитела к Co-HSA в группе пациентов с НСМ выявлены у 11 (50%) пациентов в ИФА, а в контрольной группе пациентов IgE-антитела к Co-HSA выявлены не были.
Как видно из приведенных данных (табл. 5), IgE-антитела к металлам - человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в сыворотке крови пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) встречались чаще, чем у пациентов контрольной группы.
Результаты выявления IgE-антител у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов, указывает на IgE-зависимую клиническую форму повышенной чувствительности к комплексу металл - белок.
❗ Обнаружение
IgE-антител не доказывает, что именно этот аллерген ответствен за клиническую симптоматику; окончательное заключение и интерпретация лабораторных данных должны быть сделаны только после сопоставления с клинической картиной и данными выявления сенсибилизации к металлам.
Анализ корреляции у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов уровня экспрессии CD63+CD203c+-базофилов под воздействием жидкости фрагментов протезов (ЖФП)-А с уровнем IgE-антител: сильная с Ni-HSA (RSpearman=0,82; р<0,05) и Co-HSA (RSpearman=0,87; р<0,05); а сCr-HSA - умеренная (RSpearman=0,41; р<0,05). Обсуждение
Результаты диагностики гиперчувствительности и аллергии на компоненты стоматологических материалов (КСМ) по приросту уровня CD63+CD203c+ базофилов, с использованными нами индукторами экспрессии, отличаются. У пациентов с кожной гиперчувствительностью к компонентам стоматологических материалов (КСМ), жидкость фрагментов протезов (ЖФП) показала большую чувствительность, чем раствор солей металлов (РСМ), для обнаружения металл-активированных базофилов.
У пациентов с КСМ-индуцированной непереносимостью стоматологических материалов (НСМ), под воздействием обоих вариантов индукторов результаты ПЦ-анализа отличались от контроля (р<0,05). Однако жидкость фрагментов протезов (ЖФП) в качестве индуктора активации CD63+CD203c+базофилов была более активной и специфичной и результаты с ней наиболее сильно коррелировали с результатами аппликационных проб (АП) и уровнями IgE-антител.
Нами замечено, что чувствительность проточной цитометрии (ПЦ) увеличивалась, если пациента обследовали раньше с момента снятия причинных ортопедических конструкций. Известно, что в среднем спустя 1 год после аллергической реакции, уменьшается чувствительность кожных проб к аллергенам (гаптенам), а в последующем это происходит равномерно год за годом. Однако все пациенты, которых мы отобрали в исследование, имели положительные результаты аппликационных проб (АП), таким образом, пациенты с потерей чувствительности по АП не изучались. Точно не известно, есть ли различия относительно кинетики потери чувствительности к компонентам стоматологических материалов (КСМ), проявляющиеся в аппликационных пробах (АП) и в экспрессии маркеров активации базофилов.
У большинства пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) обнаружена аллергия на соли металлов в РАПЛ и трансбуккальном тесте. Полученные нами результаты при использовании в качестве аллергена жидкость фрагментов протезов (ЖФП) показали, что чувствительность проточной цитометрии (ПЦ) была более высокой и имела статистическую значимость, чем с раствором солей металлов (РСМ). Это предполагает, что активация базофилов зависит от природы индуктора их активации in vitro.
У пациентов без жалоб на непереносимость стоматологических материалов (НСМ) и с отрицательными аппликационными пробами (АП) наши индукторы не являются активаторами базофилов с экспрессией CD203c, что позволяет предположить наличие специфического пути активации для этих "модельных аллергенов" у пациентов с НСМ. В сущности, базофилы или тучные клетки могут быть активированы различными механизмами связывания IgE-антител или через клеточные рецепторы. Поэтому тест активации базофилов отражает как IgE-зависимую, так и неспецифическую гиперчувствительность.
На сегодняшний день нет единого мнения насчет того, что использовать в качестве индуктора для диагностики гиперчувствительности к компонентам стоматологических материалов (КСМ) in vitro. Соли металлов в настоящий момент наиболее часто используемый аллерген. Однако, по мнению некоторых авторов для наиболее достоверной диагностики гиперчувствительности необходимо использовать компоненты причинных стоматологических материалов, которые получают путем их измельчения твердосплавной фрезой и настаивания в течение двух суток. Однако абразивные материалы, используемые при их измельчении, также попадают в получаемый порошок, и в последующем оказывают сильное цитотоксическое действие на лейкоциты. Поэтому мы настаивали не стружку, а зубопротезные сплавы, не подвергшиеся воздействию.
Кроме того, известно, что сами по себе ионы металлов не являются полноценными аллергенами, а приобретают антигенные свойства при связывании с белками ротовой жидкости и плазмы крови, поэтому мы добавляли к ним человеческий сывороточный альбумин (ЧСА).
Различие в степени чувствительности активации CD63CD203cк жидкости фрагментов протезов (ЖФП) и раствора солей металлов (РСМ), как индукторов, может иметь различные объяснения. Это может быть связано с выбранной нами длительностью инкубации с данными активаторами, возможно не самой оптимальной для экспрессии CD63+CD203c+. Возможно для раствора солей металлов (РСМ) более подходящим было бы большее время инкубации с кровью пациента. С другой стороны, жидкость фрагментов протезов (ЖФП) содержит все компоненты, выделяющиеся из сплавов в раствор, и несмотря на их низкую концентрацию, соединяясь с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) они создают аллерген-индуктор, вызывающий экспрессию CD63+CD203c+на базофилах, а растворы солей металлов (РСМ), формируют аллерген иной специфичности чем жидкость фрагментов протезов (ЖФП).
Положительные результаты теста активации базофилов, у АП-отрицательных пациентов, могут быть как с использованием РСМ, так и ЖФП и могут быть обусловлены неспецифической гиперчувствительностью.
Хотя аппликационные тесты (АП) остаются золотым стандартом для диагностики аллергии на компоненты стоматологических материалов (КСМ), ложноположительные АП безусловно имеют место, так как в большинство панелей для определения аллергии к металлам входят растворы солей металлов в концентрациях порядка 1г/100мл или 1моль/л. Однако они могут различаться использованными в их изготовлении растворителями (вода, спирт, масла, вазелин), анионами (хлориды, сульфаты, нитраты и т.д.). Это обуславливает определенную вариабельность получаемых результатов. Так как панели включают в основном вещества, имеющие наиболее высокий аллергенный потенциал, в принципе получаемые результаты имеют определенный параллелизм, что позволяет использовать их в клинических целях.
Однако остается неясной достоверность результатов такой диагностики при сравнении аппликационных тестов с тестом активации базофилов, что подчеркивает его диагностическое значение, как способа исключения или подтверждения аллергии на компоненты стоматологических материалов (КСМ) для пациентов, нуждающихся в протезировании.
❗Выводы:
1⃣ После инкубации лейкоцитов крови, пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ)и кожной гиперчувствительностью к солям металлов с жидкость фрагментов протезов (ЖФП) и раствором солей металлов (РСМ), происходит увеличение или снижение количества CD63+CD203c+ базофилов.
3⃣ Данные, полученные при использовании жидкости фрагментов протезов (ЖФП) в качестве индуктора активации CD63+CD203c+, сильно коррелировали с результатами аппликационными тестами (АП) с 3%-ным раствором NiCl2 (RSpearman=0,79; p <0,05) и с 1%-ным раствором CоCl2 (RSpearman=0,87; p <0,05) и умеренно с 3% раствором CrCl3 (RSpearman=0,68; p <0,05) через 48 ч с момента постановки АП. При стимуляции базофилов раствором солей металлов (РСМ) отмечена умеренная корреляция теста с результатами АП с растворами солей: NiCl2 (RSpearman =0,56; p <0,05), CrCl3 (RSpearman =0,54; p <0,05) и CоCl2 (RSpearman =0,62; p <0,05).
4⃣ У пациентов с кожной гиперчувствительностью к металлам (n=22) выявлены IgE-антитела к: Ni-HSA - у 72,7% пациентов, Cr-HSA - у 63,6% пациентов, Co-HSA - у 50% пациентов. У пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) повышение уровня экспрессии CD63+CD203c+ базофилов под воздействием жидкости фрагментов протезов (ЖФП) сильно коррелировало с уровнем IgE-антител к Ni-HSA (RSpearman=0,82; р<0,05), Co-HSA (RSpearman=0,87; р<0,05) и с Cr-HSA - умеренно (RSpearman=0,41; р<0,05).
5⃣ Тест активации базофилов и определение IgE-антител рекомендуется использовать для выявления гиперчувствительности и аллергии у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ).
✏ Непереносимость стоматологических материалов
При кожной базофильной гиперчувствительности наблюдается опосредованная лимфоцитами замедленная аллергическая реакция с участием значительного количества базофилов.
Аппликационные кожные пробы (АП) рассматриваются как золотой стандарт тестирования на предмет аллергии к компонентам стоматологических материалов (КСМ) Однако, их результаты не всегда совпадают с реакциями слизистой оболочки полости рта (СОПР). Недостатки аппликационных кожных проб (АП) пробуждают интерес к поиску надежных тестов in vitro для подтверждения аллергии к компонентам стоматологических материалов.
Маркер активации базофилов CD63 (гранулоцит-ассоциированный тетраспан), исследовался ранее и сравнивался с аппликационными кожными пробами (АП), в результате чего сообщалось о его меньшей чувствительности и меньшей специфичности для диагностики лекарственной аллергии. Другой маркер активации базофилов - CD203c при лекарственной и пищевой аллергии (экто-нуклеотид-пирофосфатаза/фосфодиэстераза, трансмембранный эктофермент II типа) изучен при разных видах аллергии и оказался достаточно специфичным.
При сравнении экспрессии CD203c с CD63 под влиянием аллергенов обнаружено, что CD203c был лучшим маркером, чем CD63, для диагностики аллергии на латекс, CD63 более специфичен, а CD203c более чувствителен при аллергии на яд пчел и ос. Третье заключило, что CD63 был более чувствительным, чем CD203c, для диагностики аллергии на миорелаксанты, аCD203c более надежный по сравнению с CD63 при диагностике аллергии на кошачью шерсть.
Совместимость дентальных сплавов с биологической средой полости рта важна для изготовления безопасных для здоровья пациентов зубных протезов. Достаточно большое количество in vivo и in vitro исследований указывает на тот факт, что, подвергаясь процессам коррозии и механического износа, дентальные металлосодержащие конструкции выделяют в среду полости рта ионы металлов. Катионы металлов, соединяясь с белками, приобретают антигенные свойства, провоцируя, как местные, так и общие негативные реакции.
Цель исследования - определение активации базофилов крови и IgE-антител на компоненты стоматологических материалов (КСМ) у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ).
❗ Материал и методы исследования
Обследовано 22 пациента в возрасте от 42 до 74 лет, из них 4 мужчин и 18 женщин, с жалобами на непереносимостью стоматологических материалов (НСМ). Все пациенты указывали на наличие причинно-следственной связи между возникновением симптомов непереносимости зубопротезного материала и фактом контакта с ним.
Контрольную группу составили 20 пациентов (3 мужчин и 17 женщин) в возрасте от 45 до 68 лет без жалоб на непереносимость стоматологических материалов (НСМ) и без гиперчувствительности к ним, сопоставимые по полу, возрасту, типу конструкций и количеству зубопротезных единиц, согласившиеся пройти обследования на наличие гиперчувствительности к зубопротезным материалам, перед плановой заменой ортопедических конструкций. Сформированные группы были сопоставимы по возрасту и полу.
Интерпретация результатов кожного тестирования проводилась согласно общепринятой методике. Все пациенты, включенные в исследование, дали и собственноручно заполнили добровольное информированное согласие на участие в работе.
Уровень гигиены оценивали по упрощенному индексу гигиены полости рта OHI-S, а выраженность воспалительного процесса - при помощи индекса GI (оценивали зубы симметричной локализации противоположной стороны челюсти).
✔ Аппликационное кожное тестирование с растворами солей металлов.
Всем участникам исследования ставили аппликационные кожные пробы с использованием специальных аппликаторов - FinnChamberonScanpor (Epitest Ltd. Oy, Tulusa, Finland) и тестовых субстанций - солей металлов Cu2+, Co2+, Cr3+, Mg2+, Mn2+, Ni2+, Ti2+, Zn2+ на вазелиновой основе (Epitest Ltd. Oy, Tulusa, Finland). В качестве отрицательного контроля использовался чистый медицинский вазелин.
✔ Определение IgE-антител к металлам в сыворотке крови.
Для выявления IgE-антител к ионам металлов мы использовали стандартную иммуноферментную тест-систему фирмы EUROIMMUN (Германия). В качестве аллергенов были использованы аллергодиски с Ni-HSA, Cr-HSA, Co-HSA, Gold-HSA. Концентрацию IgE в исследуемых образцах определяли, внося полученные значения оптической плотности в калибровочный график.
✔ Подготовка компонентов стоматологических материалов (КСМ) для теста активации базофилов методом проточной цитометрии (ПЦ).
Жидкость фрагментов протезов (ЖФП), получали путем настаивания образца Co-Cr-сплава для изготовления ортопедических конструкций в 10 мл воды специальной очистки в течение 30 дней. Объем растворителя (10 мл) определяли согласно рекомендациям ISO 10993-5. Контролем служил растворитель без исследуемых образцов. Концентрацию ионов металлов в ЖФП определяли методом масс-спектрометрии.
Образец сплава для изготовления ортопедических конструкций "Gialloy PA" помещали в стерильную закрывающуюся пластиковую пробирку с растворителем и инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 дней. В течение всего периода инкубации ежедневно взвесь перемешивали на шейкере при комнатной температуре по 60 минут. Полученную жидкость, в количестве 1 мл помещали в стерильные полипропиленовые пробирки и заливали 1 мл 1,8% забуференного раствора хлорида натрия (ЗФР). Таким образом, получали ЖФП для инкубации с лейкоцитами крови.
Перед использованием в жидкость фрагментов протезов (ЖФП) добавляли человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в концентрации 2 г/л, в объеме, равном полученной жидкости. Масса образца для инкубации составила 4,4 г; при взвешивании на электронных весах Adventurer PRO AV 264. Наряду с хромом и кобальтом ЖФП содержала другие ионы (табл. 1).
В качестве негативных контролей использовались образцы нестимулированной цельной крови, инкубированной с ЗФР и ЧСА. Образцы крови пациентов разделяли в 4 пробирки (12×75 мм), использовали 100 мкл крови на тест: 2 стимулятора и 2 негативных контроля активации.
✔ Фенотипирование клеток
Для фенотипирования клеток кровь брали натощак из локтевой вены в пробирки с гепарином (20 Ед/мл). После добавления к 100 мкл гепаринизированной цельной крови в пробирки по 2,5 мкл жидкость фрагментов протезов (ЖФП) и раствора солей металлов (РСМ), исследуемые образцы ресуспендировали и культивировали в течение 15 мин при 37 °С в термостате. После чего добавляли 2,5 мкл раствора моноклональных антител CD203c-РЕ и CD63-FITC, перемешивали на вортексе и инкубировали 15 минут при комнатной температуре, затем добавляли раствор, лизирующий эритроциты, и инкубировали при 37 °С еще 10 мин, добавляли 500 мкл буферного раствора и фенотипировали.
Исследование проводили на проточном цитометре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc., США) с использованием моноклональных антител CD203c-РЕ и CD63-FITC. Использовали моноклональные антитела производства "Invitrogen Corporation", "Life Technologies Corporation", "Beckman Coulter",США.
✔ Статистический анализ
Результаты ПЦ-анализа анализировались вслепую, лаборант-оператор не знал о диагнозах пациентов. Наоборот, диагностика аллергии проводилась, прежде чем результаты проточной цитометрии (ПЦ) становились известны.
Расчеты показателей проводились в программе Statistica 10,0. Данные, подчиняющиеся закону нормального распределения (Shapiro-Wilkp>0,05), обрабатывались с помощью критерия T-test, непараметрические данные - с помощью критериев Mann-Whitney UTest (M-U), парного теста Wilcoxon Matched Pairs Test c указанием уровня достоверности расчета (p). Корреляция показателей оценивалась с помощью непараметрического теста Spearman Rank Order Correlations с указанием степени и уровня достоверности расчета (p). Для оценки значимости критериев применялся ROC-анализ с указанием чувствительности, специфичности, уровня значимости (AUC), достоверности (p). ROC-анализ проводили в программе MedCalc.
О качестве метода диагностики судили по экспертной шкале, которая базируется на величине AUC и имеет несколько градаций: площадь AUC, равная 0,9-1 - отличное качество модели, 0,8-0,9 - очень хорошее, 0,7-0,8 - хорошее, 0,6-0,7 - среднее, 0,5-0,6 - неудовлетворительное.
❗ Результаты исследования
✔ Аппликационные пробы
В опытную группу (n=22) были включены пациенты с положительными аппликационными пробами (АП) на соли металлов. У 6 (27,3%) пациентов АП были резко положительными, у 4 (18,2%) - сильноположительными и у 5 (22,7%) пациентов положительными к раствору соли NiCl2 (3%). К раствору соли CrCl3 (3%) по результатам проведения аппликационных проб (АП) у 5 (22,7%) пациентов были отмечены резкоположительные реакции, у 3 (13,63%) пациентов - сильноположительные и у 3 (13,63%) пациентов положительные реакции.
Кожная гиперчувствительность к раствору соли CoCl2(1%) у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) выявлена по аппликационным пробам (АП) у 8 пациентов, из них у 4 (18,2%) пациентов реакция была резкоположительной, у 2 (9%) пациентов сильноположительной и у 2 (9%) пациентов положительной.
При этом результаты проведения аппликационных проб (АП) были одновременно положительными на NiCl2 (3%) и CrCl3 (3%) - у 7 (31,8%) пациентов, на NiCl2 (3%) и CоCl2 (1%) - у 5 (22,7%) пациентов; на CrCl3 (3%) и CоCl2 (1%) - у 2 (9%) пациентов, а на NiCl2 (3%), CrCl3 (3%) и CоCl2 (1%) - у 2 (9%) пациентов.
✔ Тест активации базофилов у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ)
У пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) показано увеличение количества CD63+CD203c+ базофилов с использованием в качестве индуктора их активации раствор солей металлов (РСМ) и жидкость фрагментов протезов (ЖФП).
Процент аллерген-активированных базофилов определяли как процент базофилов, экспрессирующих маркер, минус его значение внестимулированной контрольной пробе. Диагностическую значимость оценивали при помощи метода ROC-анализа (анализа кривой Receiver-Operatorcharacteristic). Устанавливали оптимальную точку (критерий) отсечения (cut-ofvalue) для изучаемых признаков и определяли площадь под кривой (AUC или areaundercurve) для сравнения диагностической значимости выбранных признаков при установлении диагноза.
По результатам тестов рассчитывали оптимальный порог процента прироста CD63+CD203c+ базофилов при оптимальных значениях чувствительности (Se) и специфичности (Sp) для различных индукторов их активации.
Наилучшее соотношение чувствительности и специфичности наблюдалось для жидкости фрагментов протезов (ЖФП-А), где AUC был равен 0,86. Этот параметр указывает на высокую диагностическую значимость этого лабораторного теста (рис. 1).
С учетом того, что получение жидкости фрагментов протезов (ЖФП) длительный процесс, требующий использования специального оборудования для оценки концентрации ионов металлов в растворе, раствор солей металлов (РСМ) является наиболее подходящим индуктором экспрессии CD63+CD203c+ на базофилах, сопоставимым по специфичности с ЖФП (рис. 1, 2) (табл. 2).
❗ Анализ корреляции результатов
Результаты, полученные при использовании жидкости фрагментов протезов (ЖФП) в качестве индуктора активации CD63+CD203c+, сильно и умеренно коррелировались результатами аппликационных проб (АП) с 3%-ным раствором соли NiCl2 через 24 ч (RSpearman=0,7; p <0,05) и 48 (RSpearman=0,79; p <0,05) ч с момента постановки. При использовании раствора солей металлов (РСМ) отмечена умеренная корреляция с результатами аппликационных проб (АП) с раствором соли NiCl2 через 48 ч с момента постановки АП (RSpearman =0,56; p <0,05) (табл. 4).
Анализ взаимосвязи результатов постановки теста активации базофилов, по увеличению экспрессии CD63+CD203c+сЖФП, выявил наличие корреляции с результатами аппликационных проб (АП) с 1%-ным раствором соли CоCl2 через 24 ч (R Spearman = 0,7; p <0,05) и 48 (RSpearman=0,87; p <0,05) ч с момента постановки. С использованием раствора солей металлов (РСМ) в качестве индуктора экспресии CD63+CD203c+ статистически значимая умеренная корреляция выявлена с результатами АП с 1%-ным раствором соли CоCl2 через 48 ч с момента постановки аппликационных проб (АП) (RSpearman=0,62; p <0,05).
❗ Определение IgЕ-антител к солям металлов
IgЕ-антитела к Ni-HSA, в группе пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) выявлены у 16 (72,7%) пациентов в иммуноферментном анализе (ИФА). При обследовании сывороток крови пациентов контрольной группы IgE-антитела к Ni-HSA были выявлены у 2 (10%) пациентов (табл. 5).
IgE-антитела к Cr-HSA в группе пациентов с кожной гиперчувствительностью обнаружены у 14 (63,6%) пациентов. У пациентов контрольной группы обнаружены IgE-антитела к Cr-HSA методом иммуноферментного анализа (ИФА) у 1 (5%) пациента.
Методом ИФА IgE-антитела к Co-HSA в группе пациентов с НСМ выявлены у 11 (50%) пациентов в ИФА, а в контрольной группе пациентов IgE-антитела к Co-HSA выявлены не были.
Как видно из приведенных данных (табл. 5), IgE-антитела к металлам - человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в сыворотке крови пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) встречались чаще, чем у пациентов контрольной группы.
❗ Обнаружение
IgE-антител не доказывает, что именно этот аллерген ответствен за клиническую симптоматику; окончательное заключение и интерпретация лабораторных данных должны быть сделаны только после сопоставления с клинической картиной и данными выявления сенсибилизации к металлам.
Анализ корреляции у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов уровня экспрессии CD63+CD203c+-базофилов под воздействием жидкости фрагментов протезов (ЖФП)-А с уровнем IgE-антител: сильная с Ni-HSA (RSpearman=0,82; р<0,05) и Co-HSA (RSpearman=0,87; р<0,05); а сCr-HSA - умеренная (RSpearman=0,41; р<0,05).
Обсуждение
Результаты диагностики гиперчувствительности и аллергии на компоненты стоматологических материалов (КСМ) по приросту уровня CD63+CD203c+ базофилов, с использованными нами индукторами экспрессии, отличаются. У пациентов с кожной гиперчувствительностью к компонентам стоматологических материалов (КСМ), жидкость фрагментов протезов (ЖФП) показала большую чувствительность, чем раствор солей металлов (РСМ), для обнаружения металл-активированных базофилов.
У пациентов с КСМ-индуцированной непереносимостью стоматологических материалов (НСМ), под воздействием обоих вариантов индукторов результаты ПЦ-анализа отличались от контроля (р<0,05). Однако жидкость фрагментов протезов (ЖФП) в качестве индуктора активации CD63+CD203c+базофилов была более активной и специфичной и результаты с ней наиболее сильно коррелировали с результатами аппликационных проб (АП) и уровнями IgE-антител.
Нами замечено, что чувствительность проточной цитометрии (ПЦ) увеличивалась, если пациента обследовали раньше с момента снятия причинных ортопедических конструкций. Известно, что в среднем спустя 1 год после аллергической реакции, уменьшается чувствительность кожных проб к аллергенам (гаптенам), а в последующем это происходит равномерно год за годом. Однако все пациенты, которых мы отобрали в исследование, имели положительные результаты аппликационных проб (АП), таким образом, пациенты с потерей чувствительности по АП не изучались. Точно не известно, есть ли различия относительно кинетики потери чувствительности к компонентам стоматологических материалов (КСМ), проявляющиеся в аппликационных пробах (АП) и в экспрессии маркеров активации базофилов.
У большинства пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) обнаружена аллергия на соли металлов в РАПЛ и трансбуккальном тесте. Полученные нами результаты при использовании в качестве аллергена жидкость фрагментов протезов (ЖФП) показали, что чувствительность проточной цитометрии (ПЦ) была более высокой и имела статистическую значимость, чем с раствором солей металлов (РСМ). Это предполагает, что активация базофилов зависит от природы индуктора их активации in vitro.
У пациентов без жалоб на непереносимость стоматологических материалов (НСМ) и с отрицательными аппликационными пробами (АП) наши индукторы не являются активаторами базофилов с экспрессией CD203c, что позволяет предположить наличие специфического пути активации для этих "модельных аллергенов" у пациентов с НСМ. В сущности, базофилы или тучные клетки могут быть активированы различными механизмами связывания IgE-антител или через клеточные рецепторы. Поэтому тест активации базофилов отражает как IgE-зависимую, так и неспецифическую гиперчувствительность.
На сегодняшний день нет единого мнения насчет того, что использовать в качестве индуктора для диагностики гиперчувствительности к компонентам стоматологических материалов (КСМ) in vitro. Соли металлов в настоящий момент наиболее часто используемый аллерген. Однако, по мнению некоторых авторов для наиболее достоверной диагностики гиперчувствительности необходимо использовать компоненты причинных стоматологических материалов, которые получают путем их измельчения твердосплавной фрезой и настаивания в течение двух суток. Однако абразивные материалы, используемые при их измельчении, также попадают в получаемый порошок, и в последующем оказывают сильное цитотоксическое действие на лейкоциты. Поэтому мы настаивали не стружку, а зубопротезные сплавы, не подвергшиеся воздействию.
Различие в степени чувствительности активации CD63CD203cк жидкости фрагментов протезов (ЖФП) и раствора солей металлов (РСМ), как индукторов, может иметь различные объяснения. Это может быть связано с выбранной нами длительностью инкубации с данными активаторами, возможно не самой оптимальной для экспрессии CD63+CD203c+. Возможно для раствора солей металлов (РСМ) более подходящим было бы большее время инкубации с кровью пациента. С другой стороны, жидкость фрагментов протезов (ЖФП) содержит все компоненты, выделяющиеся из сплавов в раствор, и несмотря на их низкую концентрацию, соединяясь с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) они создают аллерген-индуктор, вызывающий экспрессию CD63+CD203c+на базофилах, а растворы солей металлов (РСМ), формируют аллерген иной специфичности чем жидкость фрагментов протезов (ЖФП).
Положительные результаты теста активации базофилов, у АП-отрицательных пациентов, могут быть как с использованием РСМ, так и ЖФП и могут быть обусловлены неспецифической гиперчувствительностью.
Хотя аппликационные тесты (АП) остаются золотым стандартом для диагностики аллергии на компоненты стоматологических материалов (КСМ), ложноположительные АП безусловно имеют место, так как в большинство панелей для определения аллергии к металлам входят растворы солей металлов в концентрациях порядка 1г/100мл или 1моль/л. Однако они могут различаться использованными в их изготовлении растворителями (вода, спирт, масла, вазелин), анионами (хлориды, сульфаты, нитраты и т.д.). Это обуславливает определенную вариабельность получаемых результатов. Так как панели включают в основном вещества, имеющие наиболее высокий аллергенный потенциал, в принципе получаемые результаты имеют определенный параллелизм, что позволяет использовать их в клинических целях.
Однако остается неясной достоверность результатов такой диагностики при сравнении аппликационных тестов с тестом активации базофилов, что подчеркивает его диагностическое значение, как способа исключения или подтверждения аллергии на компоненты стоматологических материалов (КСМ) для пациентов, нуждающихся в протезировании.
❗Выводы:
1⃣ После инкубации лейкоцитов крови, пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ)и кожной гиперчувствительностью к солям металлов с жидкость фрагментов протезов (ЖФП) и раствором солей металлов (РСМ), происходит увеличение или снижение количества CD63+CD203c+ базофилов.
2⃣ Наивысшей диагностической эффективностью обладает жидкость фрагментов протезов (ЖФП), (чувствительность - 72,7%; специфичность - 90,5%; AUC 0,86; p=0,0003), чем раствор солей металлов (РСМ).
3⃣ Данные, полученные при использовании жидкости фрагментов протезов (ЖФП) в качестве индуктора активации CD63+CD203c+, сильно коррелировали с результатами аппликационными тестами (АП) с 3%-ным раствором NiCl2 (RSpearman=0,79; p <0,05) и с 1%-ным раствором CоCl2 (RSpearman=0,87; p <0,05) и умеренно с 3% раствором CrCl3 (RSpearman=0,68; p <0,05) через 48 ч с момента постановки АП. При стимуляции базофилов раствором солей металлов (РСМ) отмечена умеренная корреляция теста с результатами АП с растворами солей: NiCl2 (RSpearman =0,56; p <0,05), CrCl3 (RSpearman =0,54; p <0,05) и CоCl2 (RSpearman =0,62; p <0,05).
4⃣ У пациентов с кожной гиперчувствительностью к металлам (n=22) выявлены IgE-антитела к: Ni-HSA - у 72,7% пациентов, Cr-HSA - у 63,6% пациентов, Co-HSA - у 50% пациентов. У пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) повышение уровня экспрессии CD63+CD203c+ базофилов под воздействием жидкости фрагментов протезов (ЖФП) сильно коррелировало с уровнем IgE-антител к Ni-HSA (RSpearman=0,82; р<0,05), Co-HSA (RSpearman=0,87; р<0,05) и с Cr-HSA - умеренно (RSpearman=0,41; р<0,05).
5⃣ Тест активации базофилов и определение IgE-антител рекомендуется использовать для выявления гиперчувствительности и аллергии у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ).