ЗАНЯТИЕ № 7

Структура нуклеиновых кислот и их роль в передаче наследственной информации
1. Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК): строение и функции. Правила Чаргаффа
Наследственность и изменчивость – это важнейшие свойства живого, которые не только отличают живое от неживого, но и определяют совместно с размножением бесконечное продолжение (непрерывность) жизни.
Из всех органических молекул способностью к саморепродукции обладают только нуклеиновые кислоты. Между тем, находясь в клетках, они контролируют их структуру и свойства (активность). Поэтому уникальность жизни в генетическом смысле заключается в том, что нуклеиновые кислоты через половые клетки обеспечивают химическую связь между поколениями. Благодаря размножению, наследственности и изменчивости жизнь видов продолжается бесконечно долго как непрерывное чередование поколений с сохранением между ними химических связей.
Подобно белкам, нуклеиновые кислоты — биополимеры, а их функция заключается в хранении, реализации и передаче генетической (наследственной) информации в живых организмах.
Существует два типа нуклеиновых кислот — дезоксирибонуклеиновые (ДНК) и рибонуклеиновые (РНК). Мономерами в нуклеиновых кислотах служат нуклеотиды. Каждый из них содержит азотистое основание, пятиуглеродный сахар (дезоксирибоза — в ДНК, рибоза — в РНК) и остаток фосфорной кислоты.
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). Сахар — дезоксирибоза, азотистые основания: пуриновые — гуанин (G), аденин (A), пиримидиновые — тимин (T) и цитозин (C). ДНК часто состоит из двух полинуклеотидных цепей, направленных антипараллельно.
РНК (рибонуклеиновая кислота). Сахар — рибоза, азотистые основания: пуриновые — гуанин (G), аденин (A), пиримидиновые урацил (U) и цитозин (C). Структура полинуклеотидной цепочки аналогична таковой в ДНК. Из-за особенностей рибозы молекулы РНК часто имеют различные вторичные и третичные структуры, образуя комплементарные участки между разными цепями.
В ДНК входят четыре вида нуклеотидов, отличающихся по азотистому основанию в их составе, — аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и тимин (Т).
В молекуле РНК также имеется 4 вида нуклеотидов с одним из азотистых оснований — аденином, гуанином, цитозином и урацилом (У). Таким образом, ДНК и РНК различаются как по содержанию сахара в нуклеотидах, так и по одному из азотистых оснований (табл. 1).
Молекулы ДНК и РНК существенно различаются по своему строению и выполняемым функциям.
Молекула ДНК может включать огромное количество нуклеотидов — от нескольких тысяч до сотен миллионов (поистине гигантские молекулы ДНК удается «увидеть» с помощью электронного микроскопа). В структурном отношении она представляет собой двойную спираль из полинуклеотидных цепей (рис. 1), соединенных с помощью водородных связей между азотистыми основаниями нуклеотидов. Благодаря этому полинуклеотидные цепи прочно удерживаются одна возле другой.
При исследовании различных ДНК (у разных видов организмов) было установлено, что аденин одной цепи может связываться лишь с тимином, а гуанин — только с цитозином другой. Следовательно, порядок расположения нуклеотидов в одной цепи строго соответствует порядку их расположения в другой. Этот феномен получил название комплементарности (т. е. дополнения), а противоположные полинуклеотидные цепи называются комплементарными. Именно этим обусловлено уникальное среди всех неорганических и органических веществ свойство ДНК — способность к самовоспроизведению или удвоению (рис. 2). При этом сначала комплементарные цепи молекул ДНК расходятся (под воздействием специального фермента происходит разрушение связей между комплементарными нуклеотидами двух цепей). Затем на каждой цепи начинается синтез новой («недостающей») комплементарной ей цепи за счет свободных нуклеотидов, всегда имеющихся в большом количестве в клетке. В результате вместо одной («материнской») молекулы ДНК образуются две («дочерние») новые, идентичные по структуре и составу друг другу, а также исходной молекуле ДНК. Этот процесс всегда предшествует клеточному делению и обеспечивает передачу наследственной информации от материнской клетки дочерним и всем последующим поколениям.
Молекулы РНК, как правило, одноцепочечные (в отличие от ДНК) и содержат значительно меньшее число нуклеотидов. Выделяют три вида РНК (табл. 2), различающиеся по величине молекул и выполняемым функциям, — информационную (иРНК), рибосомальную (рРНК) и транспортную (тРНК).
Информационная РНК (и-РНК) располагается в ядре и цитоплазме клетки, имеет самую длинную полинуклеотидную цепь среди РНК и выполняет функцию переноса наследственной информации из ядра в цитоплазму клетки.
Транспортная РНК (т-РНК) также содержится в ядре и цитоплазме клетки, ее цепь имеет наиболее сложную структуру, а также является самой короткой (75 нуклеотидов). Т-РНК доставляет аминокислоты к рибосомам в процессе трансляции — биосинтеза белка.
Рибосомальная РНК (р-РНК) содержится в ядрышке и рибосомах клетки, имеет цепь средней длины. Все виды РНК образуются в процессе транскрипции соответствующих генов ДНК.
Молекула РНК также является полинуклеотидом, но имеет одну цепочку. Вместо тимина в ее состав входит урацил, а вместо дезоксирибозы сахар рибоза.
У некоторых вирусов РНК является хранителем наследственной информации и имеет в молекуле 2 цепочки.
В клетке имеются три вида РНК. 3 – 4% от всей РНК составляет информационная РНК (и-РНК): она «переписывает» генетическую информацию с ДНК и переносит ее в рибосомы – место сборки белковых молекул. Рибосомальная РНК (р-РНК) составляет 80 -85 % от всей РНК. Она входит в состав рибосом и обеспечивает пространственное взаиморасположение и-РНК и т-РНК. Транспортная РНК (т-РНК) транспортирует (переносит) аминокислоты из цитоплазмы в рибосомы. т-РНК составляет 10-20% от всей РНК.
Рибонуклеиновые кислоты находятся в ядре, в цитоплазме, в митохондриях и пластидах.
Функции РНК: участие в синтезе белковых молекул (молекул полипептидов).
Пра́вила Ча́ргаффа — система эмпирически выявленных правил, описывающих количественные соотношения между различными типами азотистых оснований в ДНК. Были сформулированы в результате работы группы биохимика Эрвина Чаргаффа в 1949—1951 гг.
До работ группы Чаргаффа господствовала так называемая «тетрануклеотидная» теория, согласно которой ДНК состоит из повторяющихся блоков по четыре разных азотистых основания (аденин, тимин, гуанин и цитозин). Чаргаффу и сотрудникам удалось разделить нуклеотиды ДНК при помощи бумажной хроматографии и определить точные количественные соотношения нуклеотидов разных типов. Они значительно отличались от эквимолярных, которых можно было бы ожидать, если бы все четыре основания были представлены в равных пропорциях. Соотношения, выявленные Чаргаффом для аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц), оказались следующими:
1. Количество аденина равно количеству тимина, а гуанина — цитозину: А=Т, Г=Ц.
2. Количество пуринов равно количеству пиримидинов: А+Г=Т+Ц.
3. Количество оснований с аминогруппами в положении 6 равно количеству оснований с кетогруппами в положении 6: А+Ц=Г+Т.
Вместе с тем, соотношение (A+Т):(Г+Ц) может быть различным у ДНК разных видов. У одних преобладают пары АТ, в других — ГЦ.
Правила Чаргаффа, наряду с данными рентгеноструктурного анализа, сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК Дж. Уотсоном и Фрэнсисом Криком.
2. Доказательства роли нуклеиновых кислот в передаче наследственной информации (конъюгация, трансформация, трансдукция) .
Изучение бактерий открыло целый ряд явлений, осветивших с новой стороны источники наследственной изменчивости и механизмы наследственной передачи. Описаны три основных механизма обмена генетическим материалом у бактерий: трансформация, трансдукция и конъюгация.
Трансформация – это перенос генетического материала от одного организма к другому. Посредством генетической рекомбинации часть трансформирующей молекулы ДНК может обмениваться с частью хромосомной ДНК донора. Явление трансформации было обнаружено в опытах английского микробиолога Ф.Гриффитса (1928 г.), работавшего с двумя штаммами пневмококка. У этих микроорганизмов обычно бывает два вида колоний: гладкие (S) и шероховатые (R). Крупные, гладкие колонии образуются бактериями, которые имеют полисахаридную капсулу, защищающую их от фагоцитоза, и из-за этого обладают вирулентностью. Бактерии, образующие мелкие, шероховатые колонии, не имеют такой капсулы и лишены вирулентности. В опытах Гриффита при введении мышам смеси живых клеток R и убитых нагреванием клеток S животные заболевали; из их органов можно было выделить клетки S, образующие при любом количестве пересевов такие же гладкие колонии. Таким образом, было показано, что клетки бактерий, обладающие определенным признаком, под влиянием какого-то вещества, содержащегося в клетках с противоположным признаком, преобразовывались, трансформировались. Это изменение свойств передавалось из поколения в поколение. (таблица 3)
В результате анализа результатов опытов было высказано предположение, что свойство вирулентности от одного штамма пневмококков к другому передают фрагментами молекулы ДНК. В 1944 г. О. Эйвери, К. МакЛеод и М. МакКарти подтвердили это предположение на более высоком методическом уровне.
ДНК вирулентного штамма в питательной среде + авирулентный живой штамм пневмококков - мыши гибнут
Трансдукцией называется перенос ДНК из одной клетки (донора) в другую (реципиент) с помощью бактериофагов и передавать соответствующие свойства. Этот способ генетического обмена был открыт в 1952 г. Н. Зиндером и Дж. Ледербергом в отношении штаммов Salmonella и фага Р22. С тех пор возможность трансдукции была подтверждена на различных бактериях и фагах. Опыт, позволивший открыть этот новый генетический механизм и новый способ изучения наследственности, заключается в следующем. U-образная трубка в нижней части была разделена посредине бактериальным фильтром. В одну половину этой трубки были помещены тифозные бактерии (Salmonella typhimurium) штамма 22А, а в другую половину трубки – штамма 2А. При этом бактериальные клетки не могли переходить сквозь перегородку.
Штамм 22А нес мутацию, блокирующую синтез триптофана Т-, и поэтому при культивировании бактерии нуждались в добавки триптофана в среду. Штамм бактерии 2А имел мутацию, блокирующую синтез гистидина Н-, и поэтому нуждался в нем при культивировании.
После инкубации этих двух разных штаммов в трубке, разделенной только бактериальным фильтром, был произведен рассев клеток обоих штаммов. При рассеве клеток штамма 22А на среде, лишенной триптофана, было обнаружено небольшое число колоний. Следовательно, некоторые клетки штамма 22А каким-то образом приобрели способность синтезировать триптофан и смогли дать колонии на среде без этой аминокислоты.
Можно было предположить, что эти измененные клетки появились или в результате обратной мутации от Т- к Т+ или перехода трансформирующего фактора от штамма 2А. Но штамм 22А отличался высокой стабильностью, и поэтому указанную частоту появления (10-5) клеток генотипа Т+ нельзя было объяснить возникновением обратных мутаций. Трансформирующий фактор в среде также не был обнаружен. Фильтрующимся агентом, переносящим ген Т+ от штамма 2А к штамму 22А, оказался бактериофаг.
Бактериальный фильтр
Таким образом, трансдукция так же, как и трансформация, является своеобразным процессом рекомбинации генов. Рекомбинация генов является одним из механизмов, осуществляющих у бактерий комбинативную изменчивость, которая у высших организмов обеспечивается мейозом.
С помощью трансформации и трансдукции осуществляется односторонний обмен наследственными факторами между бактериями. И эти процессы в какой-то мере компенсируют отсутствие у них настоящего полового процесса.
Поиски полового процесса у бактерий в течение длительного времени были безуспешными. Лишь после того, как были разработаны методы селективных сред и получены штаммы биохимических мутантов, Дж. Ледербергу и Е. Татуму удалось в 1946 г. доказать наличие своеобразного полового процесса у Escherichia coli на примере штамма К12. Процесс переноса генетической информации от одной бактерии к другой при контакте клеток получил название конъюгации.
В опытах Дж. Ледерберга и Э. Татума (1946 г.) были взяты два штамма, различающиеся по генотипу: В-М-Р+Т+ и В+М+Р-Т-. Клетки обоих ауксотрофных штаммов в течение некоторого времени выращивали в смешанной культуре, а затем высевали на минимальную среду. Ни один из двух исходных штаммов не мог расти на этой среде. Однако на каждые 109 посеянных клеток из смешанной культуры на минимальной среде вырастало около 100 колоний. По генотипу эти клетки могли быть только В+М+Р+Т+.
Чтобы установить, нужен ли для процесса передачи информации физический контакт клеток, Б. Дэйвис поместил оба штамма в U-образную трубку, плечи которой были разделены бактериальным фильтром. После нескольких часов инкубации он высеял клетки на минимальную среду. Колонии на ней не выросли. Отсюда следовал вывод о том, что для появления рекомбинантов необходим непосредственный контакт между бактериальными клетками. Это заключение было сделано на основе чисто генетических экспериментов. Позднее с помощью электронной микроскопии были получены фотографии конъюгирующих бактерий, соединенных друг с другом тонким мостиком-пилем. Эти данные свидетельствовали о том, что E. сoli имеет определенный тип скрещивания, называемый конъюгацией, когда генетический материал может передаваться между клетками, временно находящимися в контакте.
3. Свойство генов. Первичные функции генов: аутосинтетическая (репликация ДНК) и гетеросинтетическая (программирование синтеза белка).
Свойства гена:
• специфичность (структурный ген детерминирует синтез данного полипептида);
• целостность (при программировании синтеза полипептида ген – неделимая единица);
• дискретность (наличие субъединиц);
• стабильность (редко изменяются);
• лабильность (способность мутировать);
• плейотропия (детерминирует развитие нескольких признаков);
• экспрессивность (степень фенотипического проявления);
• пенетрантность (частота фенотипического проявления гена).
Классификация генов по функциям:
1. Структурные гены несут информацию о различных видах РНК, ферментах и белках-гистонах.
2. Функциональные гены: гены модуляторы, усиливающие или ослабляющие действие структурных генов (ингибиторы, интеграторы, модификаторы) и гены-регуляторы, контролирующие работу структурных генов (регуляторы и операторы).
Классификация последовательностей ДНК:
1. Уникальные (1 геноме) – входят в состав структурных генов и детерминируют структуру полипептидов.
2. Повторяющиеся (десятки, сотни, миллионы раз) – промоторы, регулируют репликацию ДНК, участвуют в кроссинговере и др.
3. Транспозоны (прыгающие гены) – мобильные генетические элементы, способные встраиваться в хромосому, перемещаться вдоль нее, регулировать процессы обмена веществ, создавать устойчивость к антибиотикам.
По месту действия гены подразделяют на:
а) функционирующие во всех клетках (гены, кодирующие ферменты энергетического обмена):
б) функционирующие в клетках одной ткани (гены, детерминирующие синтез миозина в мышечной ткани):
в) специфичные для одного типа клеток (гены гемоглобина в незрелых эритроцитах).
Генотип соматических клеток одинаков, но клетки разных тканей отличаются. В различных клетках работают разные гены. Область проявления действия гена – поле действия гена (гены детерминирующие развитие определенных дерматоглифических показателей на пальцах, ладонях и стопах). Гены функционируют непостоянно (гены, детерминирующие синтез половых гормонов, работают с момента полового созревания, а к старости их функция снижается). Время работы гена – период его функционирования.
Гены выполняют в клетке две основные функции.
а) Гетеросинтетическая функция – это программирование биосинтеза белка в клетке.
б) Аутосинтетическая функция – репликация ДНК (самоудвоение ДНК).
4. Генетический код и его свойства. Этапы реализации генетической информации в клетке.
Информация о структуре белков «записана» в ДНК в виде последовательности нуклеотидов. В процессе транскрипции она переписывается на синтезирующуюся молекулу и-РНК, которая выступает в качестве матрицы в процессе биосинтеза белка. Определенному сочетанию нуклеотидов ДНК, а следовательно, и и-РНК соответствует определенная аминокислота в полипептидной цепи белка.
Запись генетической информации в виде последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК и и-РНК, называется генетическим кодом. Триплет нуклеотидов, кодирующий определенную аминокислоту, называется кодоном. Кодон – это элементарная функциональная единица гена.
Свойства генетического кода:
- триплетность: одной аминокислоте в молекуле полипептида соответствует один кодон;
- универсальность: у всех живых организмов один и тот же кодон определяет одинаковые аминокислоты;
- неперекрываемость: один нуклеотид входит в состав только одного триплета;
- вырожденность, или избыточность: одну аминокислоту может кодировать несколько триплетов (аминокислот – 20, возможных триплетов - 64);
- непрерывность (нет разделительных знаков между нуклеотидами);
- однонаправленность (образование и-РНК происходит в направлении от 3' конца к 5' концу).
- наличие среди триплетов инициирующих кодонов (с них начинается биосинтез белка), кодонов – терминаторов (обозначают конец биосинтеза белка).
Соответствие порядка нуклеотидов в молекуле ДНК порядку аминокислот в молекуле полипептида называется колинеарностью.